蛋白质印迹不是一门精确的科学，特别是在方法论意义上，直接获得**的，出版物就绪的结果并不是常态。但是，您可以采取一些步骤来优化Western印迹实验，并确保它们能够以**佳方式开始。这种微调过程称为优化，Western印迹方案的几个阶段可以从中受益。
您的蛋白质印迹实验早在您获得膜之前就开始了。你可以追溯到样品制备，但为了空间的利益，让我们从样品分离开始。通过这个，你可以得到你放入的东西 - 如果没有一个好的凝胶，你将无法得到一个好的膜，它将从那里向下螺旋。如果你自己涂上凝胶，要特别注意确保化妆的均匀性。选择正确的丙烯酰胺百分比（参见Proteintech的 Western blot协议 [PDF]）。通过抵抗在高电压下运行凝胶的诱惑并使用等效体积的1x样品缓冲液填充空孔，避免染色前“微笑”效应。
**重要的是，加入均匀量的蛋白质; 通过测定确定蛋白质浓度，并准备减少您的装载量，如果您获得“条纹”印迹。Proteintech验证实验室发现，每个泳道30μg蛋白质通常会产生无条纹和良好分离的条带。
您的膜选择可以对Western印迹实验的结果产生巨大影响。主要的两种膜类型是PVDF和硝酸纤维素，但现在消费品市场上有几种版本，包括例如针对基于荧光的免疫检测优化的膜或低分子量蛋白质。
PVDF因其韧性，稳定性和对大多数酸和碱的耐受性而受到重视（这意味着它是那些希望剥离和重新探测印迹的人的**膜）。PVDF膜还提供比硝酸纤维素更好的蛋白质保留。
硝酸纤维素膜易于堵塞，通常可提供高信噪比。但是，你将无法剥离和重新探测它们。并注意硝酸纤维素膜的孔径。
**后，关于实验室传统的一句话：不要害怕因实验室规范而改变膜类型。尝试不同的东西可能是**蛋白质印迹的关键。
假设您已经付出了所需的努力来 选择您的抗体（Proteintech也提供了指南），您的下一步应该是确定**佳的工作抗体浓度。
抗体与抗原之间的结合速率（亲和常数）受其在溶液中的相对浓度（以及其他变量，如温度和pH）的影响。抗原丰度通常在Western印迹中固定，因此您通常需要调整抗体浓度以获得更好的印迹。以有组织的方式进行此操作 - 测试几种稀释的抗体，同时保持所有其他参数不变 - 将帮助您确定实验的**佳抗体浓度。
此步骤称为抗体滴定，应在每次使用新抗体或一组实验条件时进行。如果您注意到新批次的多克隆抗体与**后一批抗体的表现不同，也应该这样做。
如何滴定抗体
许多公司在其抗体数据表中提供了推荐的稀释度，这些通常是很好的球场数据，可以帮助您入门; 然而，仍然建议滴定抗体，因为用于获得推荐稀释度的条件可能与您自己的非常不同。如果产品数据表建议使用1：1000的稀释度，请尝试1：250,1：500,1：1000,1：2000和1：4000的系列。
一般情况下，如果您将推荐的稀释液加上推荐稀释液的两倍和一半稀释液（另一侧稀释液稀释液），您将处于正确的轨道上。如果没有推荐的稀释液开始，请尝试1μg/ ml的纯化抗体作为起点。请记住保持所有其他协议参数相同，例如样品类型，孵育时间，洗涤时间和温度。
关于二抗的说明
也许你必须尝试不同浓度的二抗 - 特别是在化学发光检测的情况下。HRP标记的第二抗体的浓度直接影响条带的外观。HRP酶太少会导致化学发光信号低，光谱或光谱缺失。另一方面，过高的浓度会产生“烧坏”的条带。这是由于衬底的快速耗尽导致中间没有信号的带。化学发光试剂孵育的长度也会有所不同（参见下面的＃6，检测）。
可以使用各种阻塞缓冲区，这些缓冲区都不适用于所有情况。为每个抗体 - 抗原对尝试几种阻断缓冲液是很重要的。请记住，基于乳汁的阻断缓冲液含有内源性生物素，糖蛋白和可能干扰信号的酶。例如，含乳的缓冲液含有活性磷酸酶，会破坏您对磷酸化蛋白质的检测; 在这些情况下，尝试替代品，如牛血清白蛋白基阻滞剂。
在大多数情况下，每当我有高背景信号时，修改下一次贯穿的洗涤步骤已被证明是有用的。通常，我通过将吐温-20浓度从0.05％增加到0.1％来实现这一点。您还可以使用以下任何一种策略来改变洗涤强度：增加洗涤时间和体积，执行额外的缓冲液更换或使用更强的洗涤剂（例如，SDS代替吐温20）。
检测阶段对于获得良好的Western印迹信号是不可或缺的。有许多化学发光试剂和化学发光替代品，如荧光检测 - 所以如果你目前的检测方法不符合实验室标准，有很多选择。例如，您可以选择具有更高灵敏度的试剂或产生更持久信号的试剂。后一种选择将不可估量地增加印迹的再现性。
在更简单的水平上，化学发光检测可以通过胶片曝光时间进行优化。这可能是**常执行的优化步骤，因为它快速而简单。始终将您的墨水暴露在一系列单独的时间点（但请记住，大约10到15分钟后，所有HRP底物将用完）。你的电影选择也会有所作为。我总是发现专门用于化学发光检测的胶片 - 而不是任何标准的放射敏感胶片 - 是**佳选择。
虽然荧光成像系统可能尚未供每个实验室使用，但您所在机构可能会提供核心或中心设施来提供此技术。基于荧光的检测系统的直接优势是它们能够同时检测多种抗体，无需剥离和重新探测您的印迹。
或者，您可以完全跳过一级抗体的二次检测，并简化您的Western印迹方案，使用HRP结合的一抗识别常见的上样对照和蛋白标签。（以下列出的相关产品均以此格式提供。）
优化的主要目的是增加特定波段的信噪比并减少非特定波段（如果存在）。不可否认，如果您选择优化上述所有变量，则需要花费大量时间; 然而，即使是一两次改动也可能有所不同，从长远来看实际上可以省时间。总的来说，我认为优化是一项非常有价值的工作 - 如果你想获得出版品质的西方印迹，那么这是一项必要的策略。
