一、试验意图
琼脂糖凝胶电泳是常用的检查核酸的办法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的运用技能，掌握有关的技能和识读电泳图谱的办法。 二、试验原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于别离、鉴定DNA、RNA分子混合物的办法，这种电泳办法以琼脂凝胶作为支持物，运用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，到达别离混合物的意图。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的搬迁速度取决于分子筛效应，即分子自身的巨细和构型是首要的影响要素。DNA分子的搬迁速度与其相对分子量成反比。不一样构型的DNA分子的搬迁速度不一样。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不一样构型分子进行电泳时的搬迁速度巨细次序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只要一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不一样的核酸分子的电荷密度大致一样，因而对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致一样。
影响核酸分子泳动率的要素首要是： 1、样品的物理性状
即分子的巨细、电荷数、颗粒形状和空间构型。通常而言，电荷密度愈大，泳动率越大。可是不一样核酸分子的电荷密度大致一样，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此规范样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动间隔作规范曲线图，能够用于测定不知道分子的长度巨细。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比方质粒分子，泳动率的巨细次序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA可是因为琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会呈现相反的状况。 2、支持物介质
核酸电泳通常运用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不一样浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔巨细不一样，是于别离不一样浓度规模的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形生长链，并经过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）穿插衔接而成，其网孔的巨细由Acr与Bis的相对份额决议。
琼脂糖凝胶合适别离长度100**60的分子，而聚丙烯酰胺凝胶关于小片段（5bp-500bp）的别离作用**佳。挑选不一样浓度的凝胶，能够别离不一样巨细规模的DNA分子。 3、电场强度
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有用别离规模跟着电压增大而减小，所以电泳时通常选用低电压，不超越4V/cm。而关于大片段电泳，乃**用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能运用聚丙烯酰胺凝胶。 4、缓冲液离子强度
核酸电泳常选用TAE、 TBE、TPE三种缓冲体系，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲才能低，必须进行南北极缓冲液的循环。TPE在进行DNA收回时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反响。所以多选用TBE缓冲液。
在缓冲液中参加EDTA，能够鳌合二价离子，按捺DNase，维护DNA。 缓冲液pH常偏碱性或中性，此刻核酸分子带负电，向正极移动。
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，能够嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照耀BE-DNA复合物时，呈现不一样的效应。254nm的紫外线照耀时，灵敏度**高，但对DNA损害严峻；360nm紫外线照耀时，尽管灵敏度较低，但对DNA损害小，所以合适对DNA样品的调查和收回等操作。300nm紫外线照耀的灵敏度较高，且对DNA损害不是很大，所以也对比适用。 #p#分页标题#e#
运用溴化乙锭对DNA 样品进行染色，能够在凝胶中参加终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中，能够在电泳过程中随时调查核酸的搬迁状况，可是假如要测定核酸分子巨细时，不宜运用以上办法，而是应该在电泳完毕后，把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min进行染色。BE见光分解，应在避光条件下4℃保留。 三、资料、试剂及用具 1、资料
ΛDNA/HindⅢ Marker（分子量规范）；试验37的质粒提取物；试验39的酶切产品；试验40的衔接产品。 2、试剂
加样缓冲液（6x）：0.25% 溴酚兰，40%蔗糖；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；酶液（10mg/ml）。 3、用具（1）电泳体系：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。 （2）紫外透射仪。 四、操作过程
1、按所别离的DNA分子的巨细规模，称取适当的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，参加适当的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热**彻底溶化，溶液通明。稍摇匀，得胶液。冷却**60℃摆布，在胶液内参加适当的溴化乙锭**浓度为0.5μg/ml。
2、取有机玻璃制胶板槽，有通明胶带沿胶槽附近封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。
3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷**60℃摆布的胶液，使之构成均匀水平的胶面。
4、.待胶凝结后，当心拔起梳子，撕下通明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 5、在槽内参加0.5×TBE 电泳缓冲液，**液面掩盖过胶面
6、把待检查的样品，按以下量在洁净载玻片上当心混匀，用移液枪加**凝胶的加样孔中。 1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品
〔+0.5μlEB 液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。〕
7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调理稳压输出，电压**高不超越5V/cm，开端电泳。点样端放阴极端。依据经历调理电压使分带明晰。
8、调查溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动**距胶板前沿约1cm处，可中止电泳。 9、染色：把胶槽取出，当心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或别的支持物上，放进EB溶液中进行染色，彻底浸泡约30min。
10、在紫外透视仪的样品台上从头铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，翻开紫外灯（360nm或254nm），经过调查孔进行调查。 五、注意事项
1、电泳中运用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，必须当心，勿感染于衣物、肌肤、双眼、口鼻等。一切操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。 2、预先参加EB时可能使 DNA的泳动速度降低15%摆布，并且对不一样构型的DNA的影响程度不一样。所认为获得较真实的电泳结果能够在电泳完毕后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB，染色过程可省掉；若凝胶放置一段时间后才调查，即便原来胶内或样品已加EB，也主张添加此步。
3、加样进胶时不要构成气泡，需在凝胶液未凝结之前及时铲除，不然，需从头制胶。4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时，溴酚兰在0.5%～1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大概相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青 FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。
