五种电泳技术的比较参数

五种电泳技术的比较 SDSPAGE 

  名词解释： 

  相对迁移率（Rf）    

  问答题: 

  1.简述SDS-PAGE的基本原理。   2.影响SDS电泳的关键因素有哪些？  AGE 

 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 

 问答题 

1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 

2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 CAME 

1.CAME的基本原理是什么？ 

2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？ PAGE 名词解释 

1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 

1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 

 

1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis 

 Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。  特点（characteristic）： 

1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。  2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。 

3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。 （一）优点（advantage) 

1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。 

2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 

3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 

5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 6.有热可逆性。 

（二）缺点(disadvantage) 

1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 

3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。  应用 

1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标   影响迁移的因素 

 the size of the molecule 

 conformation of the molecule   the agarose concentration of a gel  Voltage 

百分浓度和分辨率限制 

 Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 

5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.  

 Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide 

gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.  

 Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High 

percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.  

琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白 

原理：      血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。 

 pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加样槽在负极，由负极到正极分别是CMLDLVLDLHDL 

2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME 特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis  3.Small sample 4.Hydrophilic  电泳图谱不齐 

①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行  电泳图谱分理不清 

①点样时血清点加不均匀 

②薄膜局部干燥 

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行  电泳速度慢 

 电流过低 

 供给薄膜的液量不足  缓冲液离子强度过高 

 薄膜中杂质  

白蛋白区带中间部分不着色，染色不足 染色时间不够、点样过多 γ球蛋白向反方向移动 

电渗现象，可提高缓冲液液面或加大电流量以改进 区带一边长一边短呈扭曲现象 

薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。  

区带拖尾或区带过于紧密 

缓冲液离子强度＜0.05可出现区带拖尾；离子强度＞0.075可出现区带过于紧密。 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 

[原理] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。 

      将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。加样：用加样器蘸取血清约5ul，垂直印在CAM粗糙面，点样区距离边缘约1.5cm，电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。 由负极到正极可分为五条条带 γ β α2 α1 白蛋白 #p#分页标题#e#

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE 

        PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。 

    过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED）为加速剂。  ¬TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合   -分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 

  ®升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 

PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。 

Acr/Bis：20~40   完全透明且有弹性；          ＜10    很脆，易碎，不透明；          ＞100   糊状不成形，易破碎 常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶 交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 

电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液  分离原理 1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 

  两层凝胶T与C不同孔径不同 

  浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。  2）缓冲液离子成分的不连续性 

甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M ）很低，移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。  3）pH值的不连续性 

     为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。 

3.分子筛效应与电荷效应 

    进入分离胶后，Gly-

成为快离子 

    分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离 

PAGE特点 

1.具有分子筛效应，分辨率高 

2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 

3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 

5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明 

6.网孔可调节  4.SDSPAGE 

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate) 是一种阴离子去污剂(anionic detergent )。 

• 作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性

(denature)而改变原有的构象; • 保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 原理 

（一）蛋白质分子的解聚 

    样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而电荷因素可以被忽略。 1、SDS 

   阴离子去污剂(anionic detergent )    变性剂(denaturant)    助溶性试剂  

    断裂分子内和分子间的氢键(hydrogen bond)     分子去折叠 

    破坏蛋白质分子的二级和三级结构 2、强还原剂 

   巯基乙醇（β-mercaptoethanal）     

   二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键(disulfide bond)断裂。 

 SDS和还原剂的作用： 

（1）分子被解聚 

（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负   

     电荷的蛋白质-SDS胶束。 

（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超         过了蛋白质分子原有的电荷量，消除      了不同分子之间原有的电荷差异。 

去污剂的选择 

无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween                   Triton 

阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium                bromide （CTAB）               cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS   deoxycholate 

电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 

    指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。 2）“皱眉”现象 

    由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 （3）“拖尾”现象 

     样品溶解不佳引起。 （4）“纹理”现象 

由于样品中的不溶颗粒引起的。 （5）偏斜现象 

    电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起 （6）带太宽 #p#分页标题#e#

     加样量太多或加样孔泄漏引起 分子量测定 

1、相对迁移率（relative mobility ，Rf） 

  Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。   测量位置应在蛋白带的中央。