30KD-10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚**不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。
2、 配制分离胶(12%)（10ml）：
将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。 4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。
5、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min， 12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。
6、上样：取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。
7、电泳：在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳**溴酚蓝行**电泳槽下端停止（约需2-3h）。
8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。 9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色**蛋白带清晰。 #p#分页标题#e#
10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。 注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。 3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。 试剂配制：
30%丙烯酰胺(29:1)配制：称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶
解。加去离子水将溶液定容**100 mL，用0.45um滤膜滤去杂质，于中4℃避光保存。 5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800
mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容**1 L后，室温保存。
10 %过硫酸胺(AP)的配制：称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 ℃避光保
存，保存时间不能超过1周。
10 % SDS的配制：称取SDS 10 g溶于100 mL灭菌的去离子水中并于50℃水浴下溶解，室温保存。如在长
期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH**
8.8，**后用去离子水定容**250 mL，室温下保存。
0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)：称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH**
6.8，**后用去离子水定容**250 mL，室温下保存。
12 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺4 mL、去离子水3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP
100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
15 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺5 mL、去离子水2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP
100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
5 % SDS-PAGE 浓胶：30%丙烯酰胺0.5 mL、去离子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP
30 μL、10 % SDS 30 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯
中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。
脱色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶**1L，搅拌均匀，室温保存备用。
转移缓冲液的配制：称取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；加入100 mL
甲醇，**后用去离子水定容**500 mL，室温下保存备用。
洗膜缓冲液(TBST)的配制：称取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌
溶解；用1 M HCl将溶液的pH值调**7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混匀；加去离子水将溶液定容**1 L后，于4 ℃保存备用。
封闭缓冲液的配制：称取0.5 g脱脂奶粉溶于10 mL TBST缓冲液中，充分混匀后备用。
0.1 M 甘氨酸缓冲液配制：称取0.75 g甘氨酸加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调**2.5，用去离子水定容**100mL后用0.22 µm 微孔虑膜过滤除菌后，将其分装并于4 ℃保存备用。
1 M Tris-HCl 缓冲液的配制：称取12.1g Tris-base，加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调**
7.5，用去离子水定容**100mL备用。 银染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。
银染氧化液：称取0.7 g高碘酸溶于100 mL去离子水，充分混匀备用。 银染显色液：浓度为0.005 g/L的柠檬酸，0.02 %的甲醛。
银氨溶液：浓度为0.67 % 的硝酸银，0.33 %的氨水，0.8 g/L的NaOH。
