一般使用辣根过氧化物酶 HRP-ECL 发光法或碱性磷酸酶 AP-NBT/BICP 显色法。
1．HRP-ECL 发光法：
将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯**可见淡绿色荧光条带（5 min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2 min，清水漂洗一下后放在定影液中**底片完全定影，清水冲净晾干，标定 Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP 显色法：
每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中，使用前将一片分装在 30 个 EP 管中，每张 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。将 PBST 或 TTBS 洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色 20 s 后每 10 s 观察一次，**条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
注：背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
