1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
2. 加一抗后**好4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4℃也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。
3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。
4. **好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。
5. 抗体的稀释倍数也要适当，不同厂商也会有不同要求。
6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后**好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，把相同的membrane做strip后再压p38，然后再strip一次，再压内标actin。
7. 做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的band以外，往往会出现非特异性的band。磷酸化抗体不好的话，甚**会压出非特异性的band，而没有你想要的band，所以压片以后，你一定要根据markers比对一下，你压出的band分子量是否正确。
8. 磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则backgroud太深盖住想要的那条band，时间过短则可能没有band或者band太浅。
9. 磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5 min 3次即可，宁愿background深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，**好不要把几张membrane叠在一起洗。
11. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后**好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚**还可跑另一个gel，压内标。但是不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。
12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。
